我院杨建华/李斌/屈良鹄团队介绍全长非帽RNA测序技术NAP-seq的原理及实验步骤

ENCODE计划揭示了人类基因组超过80%的基因组区域能够转录产生“暗物质”之称的RNA。根据RNA的5'端是否具有帽子修饰结构，这些可以被分为两大类：1）帽子结构的（capped RNA，capRNA）；2）非帽RNA（noncapped RNA，napRNA）。除mRNA和部分长非编码外，其余几乎所有均属于napRNA。

这些napRNA不仅通过作为非编码RNA（ncRNA）调控多种生物学过程，还作为加工产物解析特定的RNA生物生成过程。然而，由于其长度异质性、末端修饰多样性以及复杂的二级结构等，鉴定这些napRNA面临巨大挑战。

为应对这一挑战，我院杨建华/李斌/屈良鹄教授团队开发了NAP-seq技术，并于2025年9月17日在Nature Protocols期刊发表了题为：NAP-seq for full-length noncapped RNA sequencing的论文，系统介绍了该方法的设计原理与实验步骤。

图1.NAP-seq的设计原理和实验步骤

1.NAP-seq技术具有以下显著优势：

1）大规模新发现：在人类和小鼠中，分别鉴定出超过16000条和9500条新的napRNA，展现出远超传统方法的发现能力。

2）单核苷酸分辨率的全面napRNA分析:定制化接头序列能够同时捕获napRNA的两端，从而在单核苷酸分辨率下解析全长序列，并发现具有特征性末端基序和结构元件的napRNA。

3）高效检测修饰RNA与复杂结构RNA：T4 PNK和SuperScript IV逆转录酶的使用，使NAP-seq能够检测多种RNA修饰和高度稳定的二级结构RNA。

4）富集低丰度napRNA：通过基于RNase H的去除策略，有效去除高丰度的rRNA、snoRNA及其他ncRNA，去除效率可达99.9%，从而显著提升低表达napRNA的发现率。

5）确保全长cDNA合成：巢式逆转录引物设计保证了长链napRNA的全长cDNA扩增，并最大程度减少错误引物引发的伪影。

6）拓展napRNA家族的检测范围:在建库前设置的片段大小选择（≥100 nt），使NAP-seq能够识别数千条被传统小RNA测序忽略的长napRNA（≥100 nt），包括C/D box RNA、H/ACA box RNA以及Pol III转录RNA的新亚类，序列长度可达约2000 nt。

7)精确定量与减少偏倚：在接头中引入条形码，有助于消除PCR扩增偏倚，并减少因末端连接效率差异导致的序列特异性偏差，实现对napRNA的更精准定量。

8)双平台整合：NAP-seq结合Oxford Nanopore测序（NAP-seq-TGS）与Illumina测序（NAP-seq-NGS）的优势，前者实现实时、直接的全长分子分析，后者提供碱基水平的高精度短读长序列。研究人员可根据不同研究需求独立或联合使用两类技术，获得更全面的napRNA特征信息。

9)高效利用样本：相较于TERA-seq等全长RNA测序方法至少需75μg RNA，且仅限ONT平台，NAP-seq仅需1μg RNA即可完成建库，极大拓展了其在有限样本研究中的适用性。

10)流程化的计算机分析：配套开发cutAdapter、napSeeker等软件与分析流程，能够快速发现并注释多类型napRNA。

图2.NAP-seq的技术亮点

2.NAP-seq展现出广泛的新应用前景：

1）临床样本和体液分析：通过检测临床样本及体液（如血浆）中的napRNA，NAP-seq可助力发现新型疾病标志物和治疗靶点，为精准医学提供新机遇。

2）极端环境微生物研究：NAP-seq可用于鉴定极端环境中微生物的多样化napRNA，揭示新型防御系统及独特生物学机制，为微生物群落研究开辟新方向。

3）RNA末端加工机制解析：NAP-seq能够系统表征非帽RNA的末端加工过程，揭示调控RNA稳定性、加工及功能的未知机制，为RNA生物学研究提供新视角。

综上，NAP-seq作为一种多功能、高精度的测序技术，不仅适用于鉴定任何细胞模型、组织和物种中的调控型napRNA，还为揭示复杂RNA调控途径提供了强大工具，在基础生物学和临床研究领域具有广阔的应用潜力。

中山大学生命科学学院杨建华教授、李斌副教授和屈良鹄教授为论文通讯作者，中山大学生命科学学院刘树榕特聘副研究员为论文第一作者，该工作得到实验室其他成员的大力支持。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41596-025-01261-6