我院微生物智造与生物防治团队在毕赤酵母高效表达重组蛋白方面取得进展

重组蛋白生产作为现代生物技术与生物制造的基础，其产品广泛应用于医药、食品等高价值领域。信号肽 (signal peptide, SP)是决定重组蛋白分泌效率的关键元件，其选择直接影响生产产量和成本效益。虽然毕赤酵母（Komagataella phaffii，原名Pichia pastoris）作为工业蛋白生产的常用底盘细胞已有超过30年的历史，但其信号肽序列与分泌能力之间的关系尚不明确，导致信号肽筛选长期依赖经验性尝试，制约了该宿主在高端生物制造中的广泛应用。

近期，我院曹立创/刘玉焕团队和王瑾雯团队合作在Chemical Engineering Journal杂志上发表了题为“ Multi-dimensional engineering enables high-yield secretion of β-galactosidase Bgal1-3 in Komagataella phaffii ”的论文（图1）。该研究系统解析了毕赤酵母信号肽序列特征与分泌效率之间的关系，并采用多维度工程策略结合高密度发酵技术，成功构建了高产β-半乳糖苷酶Bgal1-3-Y497F的工程菌株。

图1 本研究的主要内容。（a）信号肽库构建和功能表征；（b）信号肽序列-功能关系分析；（c）整合策略提高重组蛋白产量；（d）工程菌株高密度发酵。

研究团队首先从 K. phaffii 基因组中筛选出64个内源信号肽，并结合文献报道的52个高性能外源信号肽，构建了一个包含116个信号肽的文库。以能够高效原位合成富含低聚半乳糖(GOS)牛奶的β-半乳糖苷酶Bgal1-3-Y497F作为报告蛋白，系统评估了各信号肽的分泌效率。研究新鉴定到35个性能优于传统α-factor的信号肽，显著扩展了该表达系统的分子工具库。更重要的是，该研究首次揭示了毕赤酵母信号肽序列特征与分泌效率之间的内在规律：内源信号肽N区偏好+1电荷，而外源信号肽N区偏好+3电荷；H区的疏水性（HS）在40-55之间时分泌效率最高，整体呈现钟形曲线分布（图2）。这些发现为信号肽的理性设计提供了重要理论依据。

图2 毕赤酵母信号肽序列特征与分泌效率之间的关系。A：内源信号肽N区。B：内源信号肽H区。C：内源信号肽C区。D：外源信号肽N区。E：外源信号肽H区。F：外源信号肽C区。

进一步的功能验证显示，对β-半乳糖苷酶Bgal1-3-Y497F具有优异分泌效果的信号肽SP25和W1，在其它重要工业酶的表达中也表现出显著优势。例如，在β-半乳糖苷酶BgaD-D的表达中，W1使分泌量提高了4.2倍；在塑料降解酶LCC-ICCG的表达中，其酶活性提高了4.8倍，显示出良好的普适性。

最后，研究团队综合运用信号肽工程、多拷贝整合、分子伴侣过表达和培养条件优化等多种策略，构建出高产β-半乳糖苷酶Bgal1-3-Y497F的工程菌株。在5L生物反应器中进行高密度发酵后，蛋白产量达到7.0 g/L（图3）。

图3 工程菌株高密度发酵。A：实验流程。B：遗传稳定性测试。C：高密度发酵和产酶情况。D：发酵上清中的目的蛋白检测。

综述所述，该研究不仅为毕赤酵母表达系统提供了更多高效信号肽元件，揭示了信号肽高分泌的序列特征，同时也为乳制品功能化升级开发了一株具有应用潜力的高性能工业菌株。

中山大学生命科学学院2023级硕士研究生李广、博士后杨向鹏和2025届硕士研究生黄磊为该论文共同第一作者，曹立创副教授和王瑾雯副教授为共同通讯作者。该研究受到国家重点研发计划、国家自然科学基金和广东省重点领域研发计划等项目支持。